Mehanizmi razmene gena kod prokariota Prenošenje dela genetičkog materijala iz ćelije donora u ćeliju recipijenta konjugacijom transformacijom transdukcijom Rekombinacijom sa hromozomom/ekstrahromozomalnom DNK recipijenta nastaje rekombinant - transkonjugant - transformant - transduktant

Transdukcija Transfer gena iz donora u recipijenta pomoću virusa U zavisnosti od specifičnosti bakteriofaga, omogućava razmenu genetičkog materijala među sojevima iste ili srodnih vrsta Generalizovana transdukcija – prenos bilo kojeg fragmenta DNK donora u recipijenta. Efikasnost niska. Specijalizovana transdukcija – prenos određenog dela DNK donora u recipijenta. Efikasnost može biti veoma visoka.

Otkriće transdukcije 1952, Joshua Lederberg i Norton Zinder 2 auksotrofna soja Salmonella typhimurium LA-2 i LA-22 Pojedinačno ne rastu na MM, međutim, protok medijuma kroz bakteriološki filter omogućava rast na MM podlozi

Generalizovana transdukcija Najčešće virulentni virusi Vezana za litički ciklus Umesto virusne DNK u virusnu česticu se upakuje bilo koji fragment domaćinove DNK odgovarajuće veličine (virus postaje ’defektan’, transdukujući fag) Model P1 fag – P1vir mutant korišćen za konstrukciju novih laboratorijskih sojeva transdukcijom Pakovanje virusne DNK u kapsid otpočinje od pac mesta Pakovanje hromozomske DNK moguće zahvaljujući pseudo-pac mestima u bakterijskom hromozomu Infekcija sledećeg domaćina rezultuje u pronalaženju homologije, homologoj rekombinaciji i integraciji donorske DNK u hromozom recipijenta

Specijalizovana transdukcija Vektori za prenos strane DNK su umereni virusi (ulazak u lizogeni ciklus) 1. uslov – integracija fagne DNK u genom domaćina (nastaje profag) 2. uslov – mora doći do lizogene indukcije (izvlačenje profaga i prelazak u lizogeni ciklus) Profag se pogrešno iseca iz hromozoma domaćina noseći deo svoje DNK i susedne gene domaćina Pošto fag prenosi samo određene gene označena je kao specijalizovana Prilikom infekcije sledećeg domaćina virus ne može da kompletira životni ciklus, jer mu nedostaje deo sopstvene DNK Preneti geni se, u slučaju homologije sa DNK recipijenta, mogu ugraditi u njegov hromozom – rezultat transduktant

Specijalizovana transdukcija (model λ fag) Model λ fag – integracija u hromozom između gal i bio Integracija zahvaljujući homologiji kratkih regiona (15 nukleotida) attP i attB (attachment sites of Phage or Bacteria) Integraza (Int i IHF proteini), mesto-specifična rekombinacija Lizogena indukcija – obrnut proces: ekscizija, isecanje fagne DNK (kodirano Int, IHF i Xis proteinima) Isecanje nepravilno → transdukujući fag nosi gal ILI bio

Otkriće transformacije, Grifit (1928) Streptococcus pneumoniae S soj - ćelije sa kapsulom (zbog kapsule daju smooth, tj. glatke kolonije) R soj - ćelije mutanti bez kapsule (zbog odsustva kapsule, kolonije su rough, tj. hrapave) kapsula je faktor patogenosti – S soj je patogeni

Otkriće hemijske prirode “transformišućeg principa” – molekul DNK (Averi, 1944) Pre transformacije R soja, suspenzija ubijenih S ćelija se tretira enzimima/modifikuje: Uklanjanje lipida (transformacija +) Uklanjanje ugljenih hidrata (transformacija +) Tretman proteazama (transformacija +) Tretman RNazama (transformacija +) Tretman DNazama - transformacija odsutna

Transformacija Indukcija kompetencije (prirodna - quorum sensing fenomen kod B. subtilis ili veštačka) Dolazi do vezivanja DNK i formiranja pore za njen prolazak Uzimanje slobodne DNK uz degradaciju jednog lanca na površini recipijenta, tako da ulazi jedan lanac (kod Bacillus) Uzimanje slobodne DNK u dvolančanoj formi, ali se u ćeliji recipijentu jedan lanac degraduje (kod Haemophilus influenzae) Integracija u hromozom recipijenta homologom rekombinacijom (za jednolančanu DNK donora se vezuju SSB proteini i RecA, koji inicira proces)

Transformacija kod Bacillus Com proteini (regulišu quorum sensing odgovor, učestvuju u vezivanju DNK i formiranju pore za njen prolazak) ComX – feromon; raste br ćel/mL → raste conc. ComX Kritičnu masu Com X registruje senzorni protein ComP (membranska histidin kinaza) i pokreće kaskadu događaja Posredstvom ComP aktivira se regulator odgovora ComA (fosforiliše se) Com A-P (fosforilisani protein Com-A) je transkripcioni aktivator koji pokreće ekspresiju comS gena ComS sprečava proteolizu ComK (kompetitivni master regulator; aktivator), akumulira se u ćeliji i vezuje se za promotore sopstvenog gena i gena uključenih u transformaciju i aktivira ekspresiju Autolizini otkrivaju DNK vezujuće proteine na površini i nukleaze (NucA) potrebne da degraduju 1 lanac Kompleksna DNK translokaza (DNK vezujući protein ComEA, permeaza/proteinski kanal ComEC i ATP vezujući protein ComFA) U ćeliju ulazi jedan lanac DNK, ’zaodeva se’ proteinima SSB i DprA DprA protein regrutuje RecA protein – traga za homologijom i katalizuje razmenu lanaca (homologa rekombinacija) Fragment usvojene donorske DNK se integriše u hromozom recipijenta)

Kompetencija (sposobnost transformacije) Sposobnost prihvatanja gole DNK Prirodna: Azotobacter, Bacillus, Haemophilus, Streptococcus, Neisseria, Thermus Veštačka: E. coli Indukovana elektroporacijom Indukovana termalnim šokom i Ca2+ jonima Lakši ulaz cirkularne DNK (plazmida)

Lederberg i Tejtum, 1946 Dejvis, 1950

Konjugacija Zahteva direktan kontakt ćelija Kodirana konjugativnim plazmidom (KP) (tra region) Donor uvek poseduje KP Recipijent nikada ne poseduje KP Dve varijante Prenos KP Drugi genetički elementi mogu biti mobilisani (ne-KP ili hromozom) F plazmid (fertility factor)

Transfer konjugativnog plazmida Gram-negativne bakterije – isključivo preko pilusa Retrakcija pilusa – formiranje konjugativnog mostića U donorskoj ćeliji replikacija plazmidne DNK – mehanizam kotrljajućeg obruča TraI enzim zaseca 1 lanac plazmidne DNK na oriT lokusu (endonukleaza) i raspliće lanac (helikaza) Replikacija istiskuje 1 lanac u ćeliju recipijenta U ćeliji recipijenta – sinteza nedostajućeg lanca i cirkularizacija Rezultat – obe ćelije su F+ Transfer konjugativnog plazmida

Transfer hromozoma konjugacijom F je epizom - integracija F u hromozom Rekombinacija specifična za mesto u regionu IS Nekoliko IS sekvenci na plazmidu, ali više kopija IS i na hromozomu - može se desiti na većem broju mesta Kada se F plazmid integriše u hromozom formira se Hfr soj (High Frequency of Recombination)

Transfer hromozoma konjugacijom Konjugacija Hfr x F-: prelazak hromozoma u ćeliju recipijenta Najčešće pređe samo deo hromozoma (veza je fragilna – prekid DNK tokom transfera i razdvajanje konjugativnog para) Primljeni fragment donorske DNK se mora integrisati u hromozom rekombinacijom ili će biti degradovan) Transfer kompletnog hromozoma domaćina je veoma redak, traje 100 min (brz proces -100 kbp se prebaci za 5min). Proces se koristio za mapiranje hromozoma kod E. coli (položaj gena u minutima) Rezultat: Hfr i F- ćelija (transfer celog F faktora veoma redak)

Konjugacija F’ x F- Rekombinacija specifična za mesto između IS sekvenci na hromozomu i plazmidu – dvosmerni proces: Integracija F faktora u hromozom Izvlačenje F faktora iz hromozoma Izvlačenje pogrešno – deo hromozoma se ’ponese’ F’ – oznaka da F faktor nosi neki gen sa hromozoma Konjugacija – velika frekvenca prenosa gena integrisanog u F Nalik specijalizovanoj transdukciji

Rekombinacija homologa rekombinacija Fundamentalan ćelijski proces odgovoran za fizičku razmenu genetičkog materijala između različitih genetičkih elemenata. homologa rekombinacija mesto-specifična (“site-specific”) rekombinacija ilegitimna rekombinacija

Homologa rekombinacija Fundamentalni biološki proces, uključuje RecA zavisnu razmenu homologih sekvenci DNK različitog porekla. Kod E.coli postoje dva glavna puta (RecBCD, RecF) sa najmanje 25 gena RecA protein se polimerizuje na ssDNK (5'3' smer) i formira se nukleo-proteinski filament koji ima afinitet za homologi segment dsDNK (invazija lanca) Prekid se formira u homologom segmentu na lancu iste polarnosti i lanci se unakrsno povezuju (Holidejeva struktura) Holidejeva struktura migrira i formiraju se heterodupleksi Holidejeva struktura se razdvaja na dva moguća načina (rezolucija pomoću RuvABC resolvaze ili RecG helikaze)

RecBCD put kod E. coli Osnovni put homologe rekombinacije kod E. coli Enzim RecBCD: helikaza, ssDNK i dsDNK egzonukleaza Do Chi sekvence (5’GCTGGTGG3’) egzonukleazna aktivnost u 3’5’ pravcu Na Chi sekvenci konverzija u RecBCD* rekombinazu – degradacija u 5’3’ smeru Formiranje ssDNK sa slobodnim 3’ krajem Polimerizacija RecA na ssDNK region – invazija homologog dupleksa – promocija homologe rekombinacije

RecF (RecFOR) put kod E. coli Alternativni put homologe rekombinacije kod E. coli RecFOR kompleks: vezuje se za ssDNK i dsDNK Dozvoljava polimerizaciju RecA na ssDNK i formiranje nukleoproteinskog filamenta Razmena genetičkog materijala između cirkularnih molekula

RecFOR – reparacija DSG (jednolančanih prekida) RecBCD – reparacija DSB

Detekcija rekombinanata Odaberemo donora i recipijenta tako da se razlikuju po svojstvu koje pratimo: Donor:Trp+ (sintetiše triptofan) Recipijent:Trp- (ne sintetiše trp) Podloga: minimalni medijum (ukoliko zasejemo samo recipijente nakon transfera DNK, rastu samo rekombinanti koji su postali Trp+)

Kako selektovati rekombinante? Donor: prototrof (thr+, leu+), koristi laktozu (lac+), osetljiv na antibiotik (npr. streptomicin - str) Recipijent: auksotrof (thr-, leu-), ne koristi laktozu (lac-), otporan na antibiotik streptomicin Selekcija rekombinanata: 1. [ MM +str+glukoza ] → rastu rekombinanti koji su postali Thr+ i Leu+ 2. [ MM+str+laktoza (nema glukoze)+ thr+leu ] → rastu rekombinanti koji su postali Lac+ 3. [ MM+str+laktoza (nema glukoze) ] → rastu rekombinanti koji su postali Thr+ i Leu+ i Lac+

Rasprostranjenost razmene gena kod Bacteria Konjugacija: E. coli, enterične bakterije, Streptococcus, Staphylococcus Transdukcija: čest proces kod Bacteria Transformacija: Bacillus, Streptococcus, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria, Thermus (prirodno kompetentne)

Rasprostranjenost razmene gena kod Archaea Mnogo manje proučavana, pre svega zbog teže kultivacije (neophodnost gajenja na čvrstim podlogama i dobijanja pojedinačnih kolonija, manje selektivnih agenasa dostupno – antibiotici novobiocin (inhibitor DNK žiraze, deluje u oba domena prokariota) ili neomicin (inhibitori sinteze proteina na prokariotskim ribozomima) Sva tri procesa dokazana i kod Archaea Konjugacija: Sulfolobus solfataricus – slično kao kod bakterija, jednosmerni transfer DNK; kod nekih halofila dvosmerni transfer Transformacija: problem sticanja kompetencije: delovanjem dvovalentnih jona metala koji destabilišu glikoproteinske zidove Archaea Transdukcija: retka, dokazana kod Methanobacterium thermoautotrophicum