Nekodirajuće RNK Složenost transkriptoma ← najveći deo genoma eukariota se transkribuje iRNK, rRNK, tRNK ncRNK – poreklom od Nekih gena Intergenskih regiona.

Презентација на тему: "Nekodirajuće RNK Složenost transkriptoma ← najveći deo genoma eukariota se transkribuje iRNK, rRNK, tRNK ncRNK – poreklom od Nekih gena Intergenskih regiona."— Транскрипт презентације:

1 Evolucija regulacije genske ekspresije (RNK jezik, remodelovanje hromatina)

2 Nekodirajuće RNK Složenost transkriptoma ← najveći deo genoma eukariota se transkribuje iRNK, rRNK, tRNK ncRNK – poreklom od Nekih gena Intergenskih regiona Promotora Introna Oba lanca DNK Uloge u regulaciji: organizacije hromatina na nivou transkripcije, obrade, stabilnosti i translacije iRNK “nadzorna” i “upravljačka” uloga RNK Zaostavština RNK sveta? “RNK interferencija”

3 Prokarioti vs. eukarioti
2% genoma kodira za različite ncRNK, oko 100 različitih ncRNK, Uloga u brzim odgovorima na promene u životnoj sredini – modifikacija metaboličkih puteva, Mala homologija sa eukariotskim ncRNK najveća između arhea i jedarcetovih ncRNK. Eukarioti: Veoma intenzivna regulacija ekspresije gena preko ncRNK, Brojni tipovi ncRNK, Npr. čovek: gena koji kodiraju za proteine 9000 nizova za male ncRNK i do nizova za duge ncRNK pseudogena

4 Osnovni mehanizam regulacije malih ncRNK
ncRNA ncRNK prepoznaje komplementarne nizove Udruživanje sa RISC (RNA-Induced Silencing Complex) - heterogeni molekulski kompleksi Argonaut proteini – osnovna komponenta RISC Više domena → postavljaju male RNK u konformaciju + domen za eventualno seckanje Prisutni kod eukariota i nekih arhebakterija Broj gena – od 1 (kvasac) do 27 (C. elegans) 2 klade Argonaut gena AGO klasa – difuzno u jedru i citoplazmi, ili u agregatima u citoplazmi (P telašca i granule stresa) PIWI klasa – u germinativnoj ćelijskoj liniji → utišavanje ME

5 Tri osnovne klase malih ncRNK
siRNK (small interfering RNA) miRNK (micro RNA) piRNK (piwi-interacting RNA) Podela na osnovu filogenetske raspodele, fiziološke funkcije, tipa RISCa, načina nastanka siRNK i miRNK Izvedene iz dsRNK Veličina od 21 – 25 nt piRNK Izvedena iz jednolančanih RNK Prisutne kod životinja (najjasnije funkcije u germinativnoj liniji) Veličina od 24 – 32 nt

6 siRNK ili dvolančana (ds) RNK RNK u obliku ukosnice Dajser siRNK dupleks P Ago RISC formiranje RISC-a siRNK/iRNK kompleks isečena iRNK 5’ 3’ “utišavanje” Prekurzori siRNK – dugi, linearni dsRNK molekuli, egzogenog ili endogenog porekla Dajser (dicer, endoribonukleaza iz familije RNaza III) Seckanje na ds siRNK (oko 21 nt) Jedan lanac (putnik, passenger) se uklanja, a drugi (vodič, guide) RISC konvertuje u aktivan oblik → siRISC Komplementarno vezivanje za drugu RNK Degradacija RNK ← seckanje molekula na jednom mestu Kompleks se odvaja Ćelijske endonukleaze završavaju seckanje Isti siRISC može ponoviti proces

7 siRNK Potpuna ili nepotpuna komplementarnost
Aktivnost u citoplazmi, ali i u jedru “tranzitna RNK interferencija” – tranzicija od utišavanja egzogenih na utišavanje endogenih RNK npr. pseudogeni za histonske dezacetilaze - Sinteza sekundarnih siRNK uz pomoć enzima RNK-zavisne RNK polimeraze (RdRP) → širenje intenziteta utišavanja - Geni za RdRP prisutni kod biljaka i nematoda -moguća transformacija RNK u dsRNK - Geni za RdRP nisu prisutni kod insekata i kičmenjaka - Utišavanje endogenih RNK moguće usled pravljenja dsRNK nizova (ponovljive sekvence u okviru istog ili različitih transkripata – npr. pseudogeni – sa sens ili antisens lanca)

8 Različite uloge siRNK Zaštita od egzogenih (patogenih) RNK (evoluciono stara uloga) CRISPR (engl. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) – kod prokariota “molekulska karta vakcinacije” (cas, crRNK) Regulacija ekspresije gena – preko endogenih RNK transkripata Regulacija ekspresije gena – preko remodelovanja hromatina Kod biljaka: casiRNK (cis-acting RNA) – poreklom od ME i tandemskih ponovaka → kontroliše metilaciju DNK i histona na mestima porekla tih RNK tasiRNK (trans-acting RNA) – endogenog porekla natsiRNK (natural antisense transcript-derived RNA) – sa antisens transkripata kada je biljka pod stresom Kod životinja – uloga u remodelovanju hromatina: Kvasac: siRNK + AGO = RITS (RNA-Induced Transcriptional Silencing) Pojava heterohromatina → RITS promoviše metilaciju 9. lizina u H3

9 miRNK Biogeneza slična siRNK
Geni za miRNK (RNK Pol II i RNK Pol III) – cis-regulatori, TF, tkivno specifična transkripcija Mirtroni – introni sa nizovima za miRNK (kod životinja) pri-miRNK – oblik ukosnice (više od 70nt kod biljaka, 55-70nt kod životinja) Dicer-like1 (biljke), Drosha (životinje) → pre-miRNK Zreli miRNK dupleks (oko 22nt) – u jedru (biljke) u citoplazmi (životinje, uloga dajsera) Udruživanje sa RISC

10 miRNK geni i mirtroni Kod biljaka Kod životinja
posebne transkripcione jedinice (malo mirtrona) 20% gena u jatima (u jatima identične sekvence ← duplikacija) Kod životinja puno mirtrona (korišćenje istih cis-regulatora kao i iRNK transkripti) posebne transkripcione jedinice – 40% gena u jatima (različite miRNK) Neki miRNK geni veoma konzervisani Chen i Rajewski (2007) – analiza 30 familija miRNK gena kod Bilateralia 18 familija pokazivalo veoma malu varijabilnost Oko 10% miRNK familija identično kod kičmenjaka i beskičmenjaka Korelacija između broja miRNK gena i morfološke složenosti Sunđeri (8), knidarije (49), nematode (207), ribe (358), glodari (720), čovek (1424) Mirtroni – evoluciono mlađi, “intronska eksaptacija”, veoma varijabilni, brza evolucija (brzo nastajanje i nestajanje).

11 Funkcionisanje miRNK Kod biljaka: Kod životinja:
Potpuna ili skoro potpuna komplementarnost sa ciljnom RNK (u 5’, 3’ ili kodirajućim nizovima) Najčešće dovode do sečenja ciljne RNK Kod životinja: Nepotpuna komplementarnost na miRNK - “semenski region” (2. do 8. nt) i adenin nakon njega na ciljnoj RNK - MRE (microRNA response element) – najčešće u 3’ UTR na iRNK Najčešće blokiranje translacije, ređe degradacija ciljne RNK (skraćivanje poliA-repića ili drugačije narušavanje stabilnosti) Kod biljaka – samo 1% iRNK prepoznaju miRNK (specifične za svaki transkript) Kod životinja – najmanje 30-50% transkripata nose MRE 1 miRNK – kontrola gena, 1 iRNK – više MRE za više miRNK

12 Funkcionisanje miRNK Kontrola kvantitativnog nivoa ekspresije
miRNK se ne vezuju za sve transkribovane iRNK nekog gena Npr. miR-9a i Sens (TF) kod drozofile – inhibicija miR-9a → varijabilnost u broju senzornih organa (nastaju iz ćelija ne-SOP) Regulisanje aktivnosti brojnih transkripcionih faktora Vremenska kontrola ekspresije gena tokom razvića Regulacija apoptoze Kontrola rasta i diferencijacije ćelije (npr. miR-430 familija važna u formiranju ektoderma, mezoderma i endoderma) Kontrola međućelijske komunikacije Ogroman značaj u evoluciji, razviću i funkcionisanju nervnog sistema

13 Evolucija miRNK Evoluciona dinamika – mnogo veća od evolucije gena koji kodiraju proteine (mnoštvo species-specifičnih miRNK) Laka promena regulatorne mreže ← mutacije dovode do nastanka ili nestanka MRE na iRNK (ili semenskog regiona na miRNK) Evolucija novih miRNK – u početku nivo ekspresije nizak Prirodna selekcija postepeno proširuje intenzitet i broj regulisanih iRNK Uloge u specijaciji – nastanak reproduktivne izolacije Reproduktivna barijera ← poremećena koordinacija regulatorne mreže u hibridnom potomstvu Veliki broj miRNK na polnim hromozomima Npr. kod ljudi X hromozom sadrži informaciju za 10% svih miRNK, a Y hromozom nema miRNK

14 Poreklo miRNK sistema (Nat.Ecol.Evol. 2017)
miRNK sistem poreklom od siRNK sistema siRNK je egzogenog porekla (prva uloga je zaštita od ME) uz kasniju ulogu u posttranskripcionoj regulaciji targetiranjem iRNK - tranzitna RNK interferencija Predačko stanje miRNK je potpuna komplementarnost sekvenci miRNK i ciljne RNK (kao kod biljaka danas) Predačko stanje je sečenje ciljne RNK Kod Bilateralia evoluirao u sistem slabijeg semenskog prepoznavanja sekvenci i odsustva sečenja ciljne RNK

15 piRNK Nastanak i evolucija vezani za pojavu germinativne ćelijske linije Poreklom od transpozona (bez sposobnosti autonomnog iskrajanja) antisens lanci transpozonske DNK – piRNK se vezuje za Piwi i AUB proteine sens lanci transpozonske DNK - piRNK se vezuje za AGO3 proteine Neke piRNK nisu poreklom od transpozona (pahitenske piRNK) Osnovna uloga – represija ME u germinativnoj ćelijskoj liniji Poznate su i uloge u represiji ME u prvim fazama ontogeneze U dugotrajnoj memoriji i plastičnosti sinapsi? piRNK u nervnim ćelijama morskog puža serotonin zavisna metilacija DNK

16 Druge male RNK snoRNK (small nucleolar RNA) i do 200nt – upravljaju proteinskim kompleksima koji dovode do hemijske modifikacije drugih RNK (rRNK, tRNK, splajsozomskih RNK, drugih ncRNK, moguće i iRNK) “RNK slične miRNK” – nastale skraćivanjem nekih tRNK Regulacija ćelijskog ciklusa i apoptoze (preko regulacije iRNK nekih gena) Grupa malih RNK – regulacija inicijacije transkripcije ← nastaju oko mesta vezivanja RNK polimeraze II PASR (promoter-associated RNA) – nt komplementarnih mestima oko promotora Nastaje skraćivanjem iRNK sa obrađenim 5’ krajem TSSa-RNK (transcription start site associated RNA) – 20-90nt komplementarnih regionu -250 do +50 nt oko mesta početka transkripcije tiRNK (transcription initiation RNA) – 18nt komplementarnih nizovima nizvodno od mesta početka transkripcije Uloga u pozicioniranju nukleozoma koji se prvi sreće u genu nakon inicijacije transkripcije

17 Duge ncRNK (lncRNK) Od 200 do preko 1000nt – veoma raznovrsne
Tkivna specifičnost, različiti obrasci ispoljavanja tokom razvića i lokalizacija u delovima ćelije Osnovni tipovi: Sens i antisens lncRNK – od jednog ili više egzona istog ili suprotnog lanca u odnosu na iRNK Bidirekcione lncRNK – lncRNK i iRNK susednog gena sa suprotnog lanca DNK kontrolisane istim cis-elementima Intronske lncRNK – izvedene iz introna gena koji kodiraju proteine Intergenske lncRNK – iz nukleotidnih nizova između gena koji kodiraju proteine lncRNK poreklom od 3’UTR regiona gena koji kodiraju proteine (u ćelijama korteksa, hipokampusa i Sertolijevim ćelijama testisa)

18 Uloge lncRNK Diferencijacija ćelija, regulacija aktivnosti TF, genomsko utiskivanje, kancerogeneza, regulacija kretanja iRNK iz jedra u citoplazmu (tzv. parapege u jedru), itd. Interakcija sa proteinskim kompleksima koji remodeluju hromatin Na stotine lncRNK prati prostorno i vremensko aktiviranje/inaktiviranje Hox gena sisara HOTAIR lncRNK – transkribuje se sa HoxC jata i učestvuje u regulaciji nekih HoxD gena Xist lncRNK – dovodi do inaktivacije jednog X hromozoma kod ženki sisara lncRNK kao posrednici u regulatornoj ulozi pojačavača – omogućavaju upetljavanje genoma tako da pojačavač dolazi u kontakt sa promotorom: pojačavač-RNK (enhancer-RNA) – transkribuje se sa pojačavača aktivaciona ncRNK (activating ncRNA) – iz nekodirajućih regiona

19 Regulacija na nivou transkriptoma
Genska ekspresija zavisi od interakcija kodirajućih i ncRNK “ceRNK hipoteza” – “kompetirajuće endogene RNK” “komunikacija” RNK molekula se ostvaruje preko miRNK i MRE na drugim RNK Preko kompeticije za istu miRNK, RNK regulišu kvantitativni nivo ekspresije → funkcija “titriranja” dostupne miRNK Pseudogeni nisu efektivno neutralni! Konzervisanost sekvence i tkivna specifičnost transkripcije (PTEN gen) lncRNK imaju MRE iRNK imaju i regulatornu ulogu Kontrola na nivou transkriptoma je trans-regulatorna na skali čitave ćelije!

20 DNK DNK umotana oko histonskih oktamera- nukleozomi pakovanje nukleozoma u hromatinsko vlakno 11 nm 30 nm a) b) histonski oktamer histon H1 2x H2A 2x H2B 2x H3 2x H4

21 Hromatin i evolucija regulacije
Remodelovanje hromatina – promene u organizaciji hromatina koje prethode transkripciji Zasniva se na: Interakciji DNK nizova i regulatornih proteina i ncRNK Histonskih varijanti u nukleozomima Enzima koji modifikuju histone ATP-zavisnoj mašineriji Formiraju obrazac ekspresije gena u ćeliji Formiraju “transkripcionu memoriju” (“histonski kod”) koji se prenosi na ćerke ćelije Kod višećelijskih životinja položaj nukleozoma je manje stabilan ← dinamična regulacija

22 Uloga histonskih varijanti u nukleozomima
Izovarijante histona H2A i H3 – ubacuju se umesto glavnih varijanti tokom interfaze H2A – varijante: H2A.X (razlika u motivu na C-kraju, fosforilacija serina na 159. mestu) – oko mesta DNK oštećenja, uključen u sistem kontrole mehanizama oštećenja DNK→ lokalna dekondenzacija hromatina H2A.Z (zamenom mnogih AK) – stabilni nukleozomi koji okružuju promotore (sprečavanje metilacije DNK), granice heterohromatina Uloga species-specifična – ili sprečava transformaciju heterohromatina u euhromatin (kvasac) ili obrnuto Uloga u odgovorima na efekte spoljašnje sredine H3 – varijante: CenH3 (CENP-A) – veliki broj zamena AK – u centromernom regionu – uloga u segregaciji hromozoma H3.3 (zamena 3-4 AK) – javlja se predominantno oko promotora (biljke i životinje) ili kodirajućim delovima (kvasac)

23 Posttranslaciona modifikacija histona
Kovalentne modifikacije histona nukleozoma (AK-a duž N-krajeva koji izlaze iz nukleozoma) 9 tipova kovalentnih modifikacija Preko 100 različitih modifikacija na različitim AK Acetilacija - enzimi: Histonske acetilaze (HAT) – prebacivanje acetilne grupe na lizin Preko 20 HAT + mnogi TF sa HAT aktivnošću Histonske dezacetilaze (HDAC) – 3 klase (I, II i III) – kod sisara HDAC I aktivna u većini tkiva, a HDAC II pretežno u mozgu i mišićima Fosforilacija – enzimi: Proteinske kinaze (fosforilacija) i fosfataze (defosforilacija) – serina i treonina Stimulišu acetilaciju, otvaranje hromatina

24 Metilacije histona – najstabilnije modifikacije
2xH2A 2xH2B 2xH4 2xH3 H3 repić 4. 9. 27. 36. metilacija “bivalentni hromatinski domeni” Histonske metiltransferaze (HMT) – otkriveno 28 različitih Signali za angažovanje proteina koji održavaju “histonski kod” Trithorax kompleks – vezivanje za nukleozome aktivnih gena Održavanje aktivnog stanja gena (memorija aktivacije) Održava trimetilaciju 4. lizina Polycomb kompleks (PRC proteini) – formiranje kondenzovanog hromatina vezivanje tri-metilovanih lizina (H3K9me3, H3K27me3) PRE/TRE nizovi – nizovi na DNK koje prepoznaju ovi kompleksi Prepoznavanje omogućavaju lncRNK

25 Metilacija DNK metilom – obrazac DNK metilacije
Konzervisanost metiloma – npr. kod primata zadržan metilacioni obrazac i u delovima genoma sa značajnim razlikama sekvence Konzervisanost tkivno-specifičnog obrasca ekspresije gena (čovek i miš) 5-metilcitozin – “peta baza” DNK Kod životinja - metilacija C u CpG dimerima (kod sisara metilovano 70-80% CpG dinukleotida) – mnoge Metazoe vrlo slabo metilovane u cis-regulatorima – inaktivacija transkripcije (ili aktivacija) unutar gena – egzoni češće metilovani od introna - aktivni geni prosečno više metilovani Kod biljaka - metilacija C u CpG, CpHpG ili CpHpH Pretežno metilacija ME i ponovljivih sekvenci, malo metilacije u promotorskim regionima

26 Metilacija DNK – enzimi
2 familije DNK metiltransferaza: Prisutne kod biljaka i životinja → nastale pre njihove divergencije Dnmt1 – metiluje C u hemimetilovanim CpG tokom DNK replikacije Kod nekih grupa koje nemaju Dnmt3 (gljive i mnogi insekti) Dnmt1 može vršiti de novo metilaciju Dnmt3 – de novo metilacija Kod biljaka ortolog DRM – siRNK dovodi DRM do mesta za metilaciju – “RNK dirigovana DNK metilacija” (RdDM) Kod životinja – piRNK i siRNK diriguju metilacijom pomoću Dnmt3 Dnmt2 – konzervisana RNK metilaza srodna Dnmt – metiluje C u tRNKasp Posebna familija metiltransferaza: CMT3 (ChromoMeThylase 3) - kod biljaka; Dim-2 - kod gljiva – metiluju ME i ponovljive nizove Životinje ih izgubile u ranim fazama evolucije Ukazuju na primarnu ulogu metilacije u odbrani od ME

27 Zašto neke životinje nemaju Dnmt?
Skorije evoluciono gubljenje enzima u nekim linijama Npr. Drosophila, Caenorhabditis elegans Predak svih životinja sa bilateralnom simetrijom imao sve tri Dnmt Kod protostoma (Arthropoda, Annelides, Mollusca) gubljenje gena u više navrata Kod deuterostoma – održan kompletan skup Dnmt (urochordate imaju samo Dnmt2) Hipoteza nestanka: Kod protostoma (Ekdizoa – artropode i nematode) – razviće i odbrana od ME postali nezavisni od regulacije DNK metilacijom → smanjenje “pritiska” selekcije na ove gene Razvijeni su drugi mehanizmi epigenetičke kontrole Kod linija koje i dalje poseduju Dnmt (npr. pčele) – oni se ne koriste za kontrolu ME, već za genomsko utiskivanje i socijalnu regulaciju