Fluorescentna spektroskopija dr Tatjana Verbić

Fluorescence Spectroscopy Principles of Fluorescence Spectroscopy Third Edition (2006) Joseph R. Lakowicz University of Maryland School of Medicine Baltimore, Maryland, USA

Fluorescence is now a dominant methodology used extensively in biotechnology, flow cytometry, medical diagnostics, DNA sequencing, forensics, and genetic analysis, to name a few. Fluorescence detection is highly sensitive, and there is no longer the need for the expense and difficulties of handling radioactive tracers for most biochemical measurements. There has been dramatic growth in the use of fluorescence for cellular and molecular imaging. Fluorescence imaging can reveal the localization and measurements of intracellular molecules, sometimes at the level of single-molecule detection. Fluorescence technology is used by scientists from many disciplines.

Prelazak atoma, jona i molekula iz osnovnog u pobuđeno stanje se može dogoditi kao posledica: ‘bombardovanja’ elektronima visoke energije, ili drugim elementarnim česticama, izlaganjem visokim temperaturama (plazma, plamen, električni luk i varnica) i izlaganjem elektromagnetnom zračenju.

Relaksacija – povratak u osnovno ili neko stanje niže energije, se dešava sudarima, fotohemijskim reakcijama i/ili emisijom fotona. U prvom procesu, koji se naziva vibraciona deaktivacija, ili neradijativna relaksacija, višak energije se oslobađa u vidu toplote. Relaksacija fotohemijskom reakcijom može dovesti do razlaganja u kom se analit u pobuđenom stanju, A*, razlaže: A*→X+Y ili do reakcije sa nekom drugom u sistemu prisutnom vrstom: A*+Z→X+Y. U oba slučaja oslobođena energija je utrošena u reakciji ili se oslobađa u obliku toplote.

Treći process predstavlja radijativnu relaksaciju, odnosno relaksaciju uz oslobađanje fotona: A*→A+hυ. Relaksacija oslobađanjem fotona koja se dešava kao posledica pobuđivanja analita termičkim izvorom se naziva emisija. Relaksacija oslobađanjem fotona koje se dešava kao posledica pobuđivanja analita apsorpcijom elektromagnetnog zračenja naziva se fotoluminiscencija. Hemiluminiscencija i bioluminiscencija predstavljaju radijativne relaksacije nakon pobuđivanja analita hemijskom, odnosno biohemijskom reakcijom.

Fluorescencija i fosforescencija su primeri fotoluminiscencije Fluorescencija i fosforescencija su primeri fotoluminiscencije. Do fluorescencije dolazi nakon pobuđivanja elektrona u singletnom stanju (spin elektrona u pobuđenom stanju je suprotan od spina elektrona u osnovnom stanju, zajedno čine elektronski par). Povratak u osnovno stanje je, u ovakvom slučaju, spinski dozvoljen proces, te je stoga verovatnoća povratka u osnovno stanje velika, a proces brz. Najčešće vreme trajanja fluorescencije je oko 10 ns (10-8 s), ali može biti u opsegu 10-10– 10-5 s.

Fosforescencija nastaje emisijom fotona iz tripletnog pobuđenog stanja (kada je elektron koji je pobuđivanjem prešao na viši energetski nivo istog spina kao elektron koji se nalazi u osnovnom, nepobuđenom stanju). Ovakvi prelazi su spinski zabranjeni, pa je i verovatnoća povratka u osnovno stanje manja, a vreme trajanja procesa duže (10-3–100 s, mada su moguća i duža vremena trajanja fosforescencije). Za razliku od fluorescencije, fosforescencija se ređe javlja u rastvoru na sobnoj temperaturi. Razlog je veća verovatnoća deaktivacije elektrona neradijativnim prelazima iz pobuđenog u osnovno stanje.

Dijagram energetskih nivoa molekula sa naznačenim promenama energije tokom procesa a) apsorpcije, b) neradijativne relaksacije i c) fluorescencije. Adaptirano iz D.A. Skoog (2013)

Fluorescein Kinin Rodamin B I fluorescencija i fosforescencija se mogu koristiti za proučavanje kako atoma tako i molekula, ali je, u analitičke svrhe, najveću primenu našla molekulska fluorescentna spektroskopija. Fluorescencija se tipično javlja kod aromatičnih jedinjenja. Fluorescein Kinin Rodamin B

Fluorescencija se može objasniti na primeru kinina (sastojak tonika) Fluorescencija se može objasniti na primeru kinina (sastojak tonika). Kada se posmatra tonik u čaši izloženoj sunčevoj svetlosti može se na površini primetiti plavičasta svetlost. Ova pojava se najbolje može videti ako se čaša posmatra pod pravim uglom u odnosu na pravac prostiranja sunčeve svetlosti. Intenzitet svetlosti postaje još jači ukoliko se smanji dielektrična konstanta rastvora, na primer, ako se u čašu sa tonikom doda manje polaran rastvarač od vode poput alkohola.

Kinin apsorbuje UV zračenje sunčeve svetlosti, a pri povratku u osnovno stanje emituje plavu svetlost talasne dužine oko 450 nm. Ovu pojavu je 1845. godine prvi primetio Sir John Frederick William Herschel (1792–1871, engleski astronom i matematičar).

Zeleni fluorescenti protein (green fluorescent protein – GFP) prvi put izolovan iz vrste meduza Aequorea Victoria 1962. godine. Od otkrića 60ih godina XX veka GFP se intenzivno koristi u biohemijskim i biološkim istraživanjima, kao što su in vivo lokalizacija proteina u ćelijama, praćenje ekspresije i prečišćavanja proteina, praćenje sekretornih puteva u ćelijama sisara itd. Posebno važnu ulogu ima u proučavanju ćelija kancera. Nobelova nagrada za hemiju dodeljena je 2008. godine za otkriće i rad sa zelenim fluorescentnim proteinom.

0 0 ??? Fluorescentni emisioni spektar Razlika u talasnim dužinama emitovane i apsorbovane svetlosti naziva se Stokes-ov pomeraj.

Gubitak energije vibracionom relaksacijom manifestuje se kao promena talasne dužine svetlosti, tako da emitovana fluorescentna svetlost ima veću talasnu dužinu od apsorbovane svetlosti. Ovu pojavu prvi je uočio Sir George Stokes 1852. godine (Sir George Gabriel Stokes, 1819–1903, irski fizičar i matematičar). Ne retko dešava se da molekul u pobuđenom stanju apsorbuje neki drugi vid energije, najčešće toplotnu, i pređe u tzv. više pobuđeno stanje. U tom slučaju, povratkom u osnovno stanje, dolazi do emisije zračenja čija je talasna dužina manja od talasne dužine apsorbovanog zračenja. Ovaj izuzetak od Stokes-ovog pravila naziva se anti-Stokes-ova fluorescencija.

Pre apsorpcije elektromagnetnog zračenja, molekul se nalazi u osnovnom, E0, stanju i u tom stanju ima određenu geometriju i solvataciju. Prelaz elektrona na viši energetski nivo je proces koji je brži od vibracija u samom molekulu i sukcesivne promene solvatacije.

Blok shema spektrofluorimetra

Većina delova je ista kao kod klasičnog spektrofotometra Većina delova je ista kao kod klasičnog spektrofotometra. Osnovne razlike su: lampa koja se koristi je najčešće ksenon lampa – lampa sa gasnim pražnjenjem koja spada u kontinualne izvore zračenja (kao i deuterijumska i volframova lampa koje se koriste kod spektrofotometra, ali je energija emitovanog zračenja znatno veća). Pokriva opseg od 250 do oko 800 nm (u opsegu 800‑1150 nm ima izražene emisione pikove). izvor se nalazi pod uglom od 90 u odnosu na detektor da bi se izbegla detekcija zračenja koje potiče od izvora;

spektrofluorimetar ima dva monohromatora, ekscitacioni (postavljen iza izvora, a ispred uzorka) i emisioni (postavljen iza uzorka). Dva monohromatora omogućavaju snimanje ekscitacionog spektra (skeniranje apsorpcije po talasnim dužinama, za fiksnu talasnu dužinu emisije), emisionog spektra (skeniranje emisije po talasnim dužinama kada je talasna dužina ekscitacije fiksna) i takozvanu sinhronu fluorescenciju, kada se menjaju i talasna dužina ekscitacije i talasna dužina emisije, ali je njihova razlika konstantna.